ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (pcr) คืออะไร? ข้อเท็จจริงเกี่ยวกับการทดสอบขั้นตอนและใช้สำหรับ

PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส) คืออะไร?

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการขยายจำนวนร่องรอยของ DNA (และในบางกรณี RNA) ที่ตั้งอยู่ในหรือบนของเหลวหรือพื้นผิวเกือบทุกชนิดที่อาจมีการสะสมของดีเอ็นเอ กุญแจสำคัญในการทำความเข้าใจ PCR คือการรู้ว่ามนุษย์สัตว์พืชปรสิตแบคทีเรียหรือไวรัสทุกชนิดมีสารพันธุกรรมเช่นลำดับดีเอ็นเอ (หรือ RNA) (ลำดับนิวคลีโอไทด์หรือชิ้นส่วนของ DNA หรือ RNA) ที่ไม่ซ้ำกับสายพันธุ์ของพวกเขา และสำหรับสมาชิกแต่ละคนของเผ่าพันธุ์นั้น ดังนั้นหากตัวอย่างมีกลุ่มของ DNA หรือ RNA, PCR เป็นวิธีที่ใช้ในการขยาย (ทำสำเนาที่เหมือนกันมากขึ้น) ของลำดับที่ไม่ซ้ำกันเหล่านี้เพื่อให้พวกเขาสามารถนำมาใช้เพื่อตรวจสอบความน่าจะเป็นสูงมาก บุคคลเฉพาะสัตว์หรือสิ่งมีชีวิตที่ทำให้เกิดโรค) ของ DNA หรืออาร์เอ็นเอติดตามที่พบในหรือเกือบทุกตัวอย่างของวัสดุ

อย่างไรก็ตามการขยาย PCR เป็นเพียงส่วนหนึ่งของการทดสอบการระบุอย่างไรก็ตาม เมื่อทำการขยายเสร็จแล้ว (ดูด้านล่าง) ส่วนขยายที่จำเป็นต้องเปรียบเทียบกับส่วนอื่น ๆ ของนิวคลีโอไทด์จากแหล่งที่รู้จัก (ตัวอย่างเช่นบุคคลเฉพาะสัตว์หรือสิ่งมีชีวิตที่ทำให้เกิดโรค) การเปรียบเทียบกลุ่มที่ไม่ซ้ำกันนี้มักจะทำโดยการวางลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สร้างโดย PCR ถัดจากลำดับนิวคลีโอไทด์ที่รู้จักจากมนุษย์เชื้อโรคหรือแหล่งอื่น ๆ ในเจลแยก กระแสไฟฟ้าไหลผ่านเจลและลำดับนิวคลีโอไทด์ต่าง ๆ เป็นแถบที่มีลักษณะเป็น "บันได" ตามประจุไฟฟ้าและขนาดโมเลกุล นี่คือการเรียกว่าเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส แถบหรือ "บันได" เช่นขั้นตอนที่ย้ายไปยังระดับเดียวกันในเจลแสดงตัวตนของลำดับนิวคลีโอไทด์ วิธีนี้เป็นวิธีการทดสอบ PCR ที่ได้รับความนิยมมากที่สุดวิธีหนึ่ง (ดูรูปที่ 1)

รูปที่ 1, แถบหรือ "บันได" เช่นขั้นตอนของ PCR สร้าง DNA ของ Mycobacterium (ความอนุเคราะห์จาก CDC)

รูป. องค์ประกอบซ้ำ (Rep) –PCR (A) และ pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (B) รูปแบบของ Mycobacterium cosmeticum แยกจากผู้ป่วย 2 รายในโอไฮโอและ 1 คนในเวเนซุเอลา Rep-PCR ดำเนินการโดยใช้ BOXA1R ไพรเมอร์ (3) และดำเนินการ PFGE ด้วยเอนไซม์ จำกัด AseI เลน 1, 2, โอไฮโอแยกโอไฮโอ OH1 และ OH2; เลน 3, 4, การควบคุมสายพันธุ์ ATCC BAA-878T และ ATCC BAA-879; เลน 5, เวเนซุเอลา VZ1 แยก มาตรฐานขนาด DNA คือ 100-bp (S1) และ 48.5-kb marker (S2)

PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส) ทำได้อย่างไร?

ในปี 1983 Kary Mullis คิดขั้นตอนพื้นฐานในการขยายลำดับดีเอ็นเอ เขาและไมเคิลสมิ ธ ได้รับรางวัลโนเบลสำหรับการพัฒนากระบวนการนี้ในปี 1993 มีขั้นตอนพื้นฐานไม่กี่ขั้นตอนตามลำดับ PCR สามารถทำได้ในหลอดเดียวที่มีสารเคมีที่เหมาะสมและเครื่องทำความร้อนที่ออกแบบมาเป็นพิเศษ รีเอเจนต์หรือสารเคมีที่จำเป็นมีดังนี้:

• ตัวอย่างที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์ (จากเลือดเส้นผมหนองการลอกผิวหนัง ฯลฯ )
• ดีเอ็นเอไพรเมอร์: ดีเอ็นเอเดี่ยวที่มีเกลียวสั้นที่ยึดติดกับลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ส่งเสริมการสังเคราะห์สายประกอบของนิวคลีโอไทด์
• DNA polymerase: เอ็นไซม์ที่เมื่อ DNA มีไพรเมอร์ผูกตัวลงไปในส่วนของ DNA ที่แนบบล็อคของ DNA เพื่อสร้างคู่เบสเสริมและสังเคราะห์สารประกอบนิวคลีโอไทด์เสริมของ DNA (การแนะนำ DNA โพลิเมอร์ทนความร้อน Taq โพลิเมอร์ที่ได้จากแบคทีเรียที่ทนความร้อนได้ปรับปรุงความสามารถในการทำ PCR ได้อย่างชัดเจน)
• ส่วนเกินจำนวนมากของหน่วยสร้างดีเอ็นเอเรียกว่านิวคลีโอไทด์ (Adenine, Thymidine, Cytosine และ Guanine ย่อมาจาก: A, T, C, และ G ตามลำดับ) มีอยู่ในสารละลาย เมื่อบล็อกเหล่านี้เชื่อมโยงกันพวกมันจะสร้างลำดับนิวคลีโอไทด์หรือดีเอ็นเอเส้นเดียว เมื่อหน่วยการสร้างเหล่านี้ผูกบล็อกแบบเสริมของพวกเขาโดยพันธะไฮโดรเจนที่อ่อนแอ (ตัวอย่างเช่น A จะผูกมัดกับ T และ G เท่านั้นกับ C) ลำดับนิวคลีโอไทด์ DNA เสริมจะเกิดขึ้นและผูกพันกับ DNA แบบเกลียวเดี่ยวแบบดั้งเดิม เมื่อการผูกเสร็จสมบูรณ์แล้วดีเอ็นเอเกลียวคู่เสริมจะเกิดขึ้นในลำดับที่เฉพาะเจาะจง

จากนั้น PCR จะเริ่มต้นด้วยส่วนของ DNA จากตัวอย่างที่วางไว้ในหลอดที่มีสารรีเอเจนต์ด้านบน น้ำยาทำความร้อนอย่างน้อย 94 C (201.2 F); ความร้อนนี้ทำลายพันธะไฮโดรเจนที่อนุญาตให้ดีเอ็นเอเสริมสร้างเป็นเส้นดังนั้นมีเพียงเส้นเดียวเท่านั้นที่มีอยู่ในส่วนผสม (นี่คือการสูญเสียสภาพธรรมชาติของ DNA ที่มีเกลียวสองเส้น)

ส่วนผสมได้รับอนุญาตให้เย็นถึงประมาณ 54 C (129.2 F) ที่อุณหภูมินี้ไพรเมอร์ DNA และ DNA polymerase ผูกติดกับ DNA เดี่ยวที่แยกตัวแต่ละเส้น (ซึ่งเรียกว่าการอบอ่อนของ DNA) เนื่องจากหน่วยการสร้างมีมากเกินไป (ความเข้มข้นสูง) ในการผสมพอลิเมอเรสจึงใช้พวกมันในการสร้างสายประกอบใหม่ของ DNA (เรียกว่าส่วนต่อขยายของ DNA) และกระบวนการนี้จะเร็วกว่าที่ 72 C (161.6 F) กระบวนการนี้สร้างโมเลกุลดีเอ็นเอแบบสองเส้นใหม่จากแต่ละเส้นของโมเลกุลดั้งเดิม

รอบนี้ซ้ำแล้วซ้ำอีกประมาณ 40 ครั้งในเครื่องที่เรียกว่า Thermal cycler ซึ่งจะทำซ้ำรอบการทำความร้อนโดยอัตโนมัติโดยจำนวนของลำดับดีเอ็นเอแต่ละครั้งจะเพิ่มเป็นสองเท่าในแต่ละครั้งที่วงจรการทำความร้อนนั้นเสร็จสมบูรณ์ สิ่งที่เริ่มแรกคือส่วนสั้น ๆ ของ DNA ที่สามารถขยายได้ถึงประมาณ 100 พันล้านฉบับหลังจาก 40 รอบเป็นสองเท่า

ทำไมแพทย์ถึงสั่งทดสอบ PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส)?

การทดสอบ PCR เป็นพื้นฐานของการทดสอบจำนวนมากที่สามารถตอบคำถามทางการแพทย์ที่หลากหลายที่ช่วยให้แพทย์วินิจฉัยและรักษาผู้ป่วย ตัวอย่างเช่นการทดสอบ PCR สามารถตรวจจับและระบุสิ่งมีชีวิตที่ทำให้เกิดโรคในผู้ป่วยโดยเฉพาะอย่างยิ่งสิ่งที่ยากต่อการเพาะปลูก (ตัวอย่างเช่น HIV และไวรัสอื่น ๆ และเชื้อราบางชนิด)

แพทย์คนอื่น ๆ สั่งการทดสอบ PCR เพื่อช่วยวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรมในขณะที่แพทย์คนอื่น ๆ ใช้ PCR เพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์ทางชีวภาพเช่นการระบุผู้ปกครองของเด็ก การทดสอบ PCR ยังใช้เพื่อระบุและจำแนกการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมและการจัดเรียงใหม่ที่พบในมะเร็งบางชนิด

อย่างไรก็ตามการทดสอบ PCR ได้รับการแก้ไขและขยายออกไปในหลาย ๆ ด้านของการสืบสวนทางวิทยาศาสตร์รวมถึงชีววิทยาวิวัฒนาการการพิมพ์ลายนิ้วมือทางพันธุกรรมการสืบสวนทางนิติเวชและอื่น ๆ อีกมากมาย

RT-PCR คืออะไร

RT-PCR เป็นการทดสอบ PCR ที่ออกแบบมาเพื่อตรวจจับและวัดค่า RNA แม้ว่าการทดสอบ PCR เบื้องต้นจะขยาย DNA แต่ไวรัสจำนวนมากและส่วนประกอบทางชีวภาพอื่น ๆ (เช่นไมโทคอนเดรีย) ใช้ RNA เป็นสารพันธุกรรม RT-PCR นั้นแตกต่างจาก PCR ทั่วไปโดยเริ่มจากการใช้ RNA และแปลง RNA Strand เป็น DNA DNA สิ่งนี้ทำได้โดยวิธีเดียวกันสำหรับ PCR ที่อธิบายข้างต้นยกเว้นการใช้เอนไซม์ที่เรียกว่า reverse transcriptase แทน DNA polymerase reverse transcriptase อนุญาตให้มีการแปล strand ของ RNA เป็น strand ที่สมบูรณ์ของ DNA เมื่อเกิดปฏิกิริยานั้นวิธี PCR ประจำสามารถใช้เพื่อขยาย DNA RT-PCR ถูกใช้เพื่อตรวจจับและศึกษาไวรัส RNA จำนวนมาก

RT-PCR ไม่ควรสับสนกับ PCR รูปแบบอื่นที่เรียกว่า PCR แบบเรียลไทม์ Real-Time PCR เป็นรูปแบบของ PCR ที่ช่วยให้การวิเคราะห์ DNA ขยายในช่วง 40 รอบปกติของกระบวนการ แม้ว่าขั้นตอนจะคล้ายกับ PCR ทั่วไปกับการขี่จักรยาน PCR แบบเรียลไทม์ใช้สีย้อมฟลูออเรสเซนต์ที่ติดอยู่กับหน่วยการสร้างหรือนิวคลีโอไทด์ขนาดเล็ก ขึ้นอยู่กับวิธีการใช้งานการเรืองแสงเกิดขึ้นเมื่อมีการขยายสายดีเอ็นเอที่เกิดขึ้น สามารถวัดปริมาณฟลูออเรสเซนซ์ได้ตลอด 40 รอบและช่วยให้ผู้ตรวจสอบสามารถวัดผลิตภัณฑ์และปริมาณที่ต้องการได้ในระหว่างรอบการขยาย สิ่งนี้มักจะช่วยให้ผู้ตรวจสอบหรือช่างเทคนิคในห้องปฏิบัติการสามารถข้ามเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสหรือขั้นตอนรองอื่น ๆ ที่จำเป็นสำหรับการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR จึงให้ผลลัพธ์ที่รวดเร็วยิ่งขึ้น

PCR แบบเรียลไทม์และ RT-PCR เป็นรูปแบบหรือการดัดแปลงของการทดสอบ PCR ดั้งเดิม อย่างไรก็ตามมีหลายรูปแบบเพิ่มเติม (อย่างน้อย 25) ที่มีอยู่และใช้เพื่อแก้ไขปัญหาเฉพาะ พวกเขาทั้งหมดมีชื่อแตกต่างกันเช่น Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-phase PCR และอื่น ๆ อีกมากมาย

PCR มีแนวโน้มที่จะได้รับการแก้ไขอย่างต่อเนื่องเพื่อช่วยตอบคำถามอื่น ๆ ในการแพทย์ชีววิทยา และสาขาวิชาอื่น ๆ